(一)3 H—TdR摻入法
1.原理白介素一2(interleukin一2,IL-2)主要由活化T細(xì)胞產(chǎn)生,又為T細(xì)胞增殖所必需,故稱T細(xì)胞生長(zhǎng)因子(T cell growth factor,TCGF)。IL一2產(chǎn)生的水平反映T ll胞的功能,不僅是免疫調(diào)節(jié)重要的研究對(duì)象,而且與臨床多種疾病密切相關(guān)。IL一2依賴細(xì)胞株是C578L/6來源的小鼠殺傷性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T—lymphocyte line,CTL)細(xì)胞系,由Gills,1977年建立,只有在IL-2存在的培養(yǎng)基中才能生長(zhǎng)。因此可作為指示細(xì)胞來測(cè)定待檢樣品中IL 2的水平。除CTLL外,絲裂原活化的T淋巴母細(xì)胞亦可作為檢測(cè)IL-2活性的指示細(xì)胞。
2.材料
(1)IL一2待測(cè)樣品,用10%FCS RPMI 1640培養(yǎng)液倍比稀釋。
(2)IL-2標(biāo)準(zhǔn)品。
(3)IL一2依賴的CTL上細(xì)胞株。
(4)lO%FCS RPMI 1640培養(yǎng)液。
(5)3 H—TdR(0.5 μci/50 μ1)。
(6)閃爍液。
(7)9999型玻璃纖維濾紙。
(8)細(xì)胞收集儀。
(9)B液閃計(jì)數(shù)儀。
3.方法
(1)用10%FCS RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌IL一2依賴的CTLL 2次,每次1000 r/min離心5 min,除去原培養(yǎng)液中的IL一2。
(2)調(diào)整細(xì)胞濃度至1×lO5/ml,96孔培養(yǎng)板中每孔加入100μl CTLL懸液(1×104/孔)。
(3)IL-2標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品分別用10%FCS RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋,IL一2標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至lOO U/ml,待測(cè)樣品稀釋至與標(biāo)準(zhǔn)品相近濃度。
(4)在96孔培養(yǎng)板中分別加入不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品100μl.各設(shè)3個(gè)復(fù)孔,37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)18~24 h。
(5)每孔加3 H—TdR 0.5μci,37℃、5%C02孵箱中培養(yǎng)4~6 h。
(6)用細(xì)胞收集儀收獲細(xì)胞于玻璃纖維紙上。
(7)干燥后,移人液閃瓶中,加入l ml閃爍液,于液閃儀中測(cè)B射線的cpm值。
4.結(jié)果分析
將IL一2標(biāo)準(zhǔn)品不同濃度和待測(cè)樣品不同稀釋度時(shí)所獲得的cpm值作圖。在y軸取標(biāo)準(zhǔn)品cpm 50%的zui高cpm值畫一與x軸平行的橫線,再分別從該線與標(biāo)準(zhǔn)品、樣品曲線交點(diǎn)處做y軸平行線,再?gòu)乃cx軸交點(diǎn)處找出標(biāo)準(zhǔn)品與樣品cpm 50%zui大值的2n值,即可計(jì)算出待檢樣品IL-2的活性單位。
© 2024 上海一研生物科技有限公司版權(quán)所有 滬ICP備14030958號(hào)-14 管理登陸 技術(shù)支持:化工儀器網(wǎng) GoogleSitemap