(一)3 H—TdR摻入法

1．原理白介素一2(interleukin一2，IL-2)主要由活化T細(xì)胞產(chǎn)生，又為T細(xì)胞增殖所必需，故稱T細(xì)胞生長(zhǎng)因子(T cell growth factor，TCGF)。IL一2產(chǎn)生的水平反映T ll胞的功能，不僅是免疫調(diào)節(jié)重要的研究對(duì)象，而且與臨床多種疾病密切相關(guān)。IL一2依賴細(xì)胞株是C578L／6來源的小鼠殺傷性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T—lymphocyte line，CTL)細(xì)胞系，由Gills，1977年建立，只有在IL-2存在的培養(yǎng)基中才能生長(zhǎng)。因此可作為指示細(xì)胞來測(cè)定待檢樣品中IL 2的水平。除CTLL外，絲裂原活化的T淋巴母細(xì)胞亦可作為檢測(cè)IL-2活性的指示細(xì)胞。

2．材料

(1)IL一2待測(cè)樣品，用10％FCS RPMI 1640培養(yǎng)液倍比稀釋。

(2)IL-2標(biāo)準(zhǔn)品。

(3)IL一2依賴的CTL上細(xì)胞株。

(4)lO％FCS  RPMI 1640培養(yǎng)液。

(5)3 H—TdR(0．5 μci／50 μ1)。

(6)閃爍液。

(7)9999型玻璃纖維濾紙。

(8)細(xì)胞收集儀。

(9)B液閃計(jì)數(shù)儀。

3．方法

(1)用10％FCS RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌IL一2依賴的CTLL 2次，每次1000 r／min離心5 min，除去原培養(yǎng)液中的IL一2。

(2)調(diào)整細(xì)胞濃度至1×lO5／ml，96孔培養(yǎng)板中每孔加入100μl CTLL懸液(1×104／孔)。

(3)IL-2標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品分別用10％FCS RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋，IL一2標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至lOO U／ml，待測(cè)樣品稀釋至與標(biāo)準(zhǔn)品相近濃度。

(4)在96孔培養(yǎng)板中分別加入不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品100μl．各設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)18～24 h。

(5)每孔加3 H—TdR 0．5μci，37℃、5％C02孵箱中培養(yǎng)4～6 h。

(6)用細(xì)胞收集儀收獲細(xì)胞于玻璃纖維紙上。

(7)干燥后，移人液閃瓶中，加入l ml閃爍液，于液閃儀中測(cè)B射線的cpm值。

4．結(jié)果分析

將IL一2標(biāo)準(zhǔn)品不同濃度和待測(cè)樣品不同稀釋度時(shí)所獲得的cpm值作圖。在y軸取標(biāo)準(zhǔn)品cpm 50％的zui高cpm值畫一與x軸平行的橫線，再分別從該線與標(biāo)準(zhǔn)品、樣品曲線交點(diǎn)處做y軸平行線，再?gòu)乃cx軸交點(diǎn)處找出標(biāo)準(zhǔn)品與樣品cpm 50％zui大值的2n值，即可計(jì)算出待檢樣品IL-2的活性單位。