(一)原理
Northern雜交(Northern blotting)是利用DNA可以與RNA進(jìn)行分子雜交來(lái)檢測(cè)特異性RNA的技術(shù),首先將RNA混合物按它們的大小和分子量通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離,分離出來(lái)的RNA轉(zhuǎn)至尼龍膜或硝酸纖維素膜上,再與放射性標(biāo)記的探針雜交,通過(guò)雜交結(jié)果可以對(duì)表達(dá)量進(jìn)行定性或定量。
Northern雜交是用來(lái)測(cè)量真核生物RNA的量和大小估計(jì)其豐度的實(shí)驗(yàn)方法,可以從大量的RNA樣本同時(shí)獲得這些信息。其基本步驟包括:①完整mRNA的分離;②根據(jù)RNA的大小通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)RNA進(jìn)行分離;③將RNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上,在轉(zhuǎn)移的過(guò)程中,要保持RNA在凝膠中的相對(duì)分布;④將RNA固定到支持物上;⑤固相RNA與探針?lè)肿与s交;⑥除去非特異結(jié)合到固相支持物上的探針?lè)肿?;⑦?duì)特異結(jié)合的探針?lè)肿拥膱D像進(jìn)行檢測(cè)、捕獲和分析。ELISA試劑盒
(二)材料
1.待檢測(cè)的RNA及制備好的探針。
2.試劑DEPC、瓊脂糖(電泳級(jí))、MOPS電泳緩沖液(10×和l×)、37%甲醛溶液(pH>4)、甲酰胺、甲醛加樣緩沖液、SSC(10×、20×、l×、0.25×)、10mg/ml溴化乙啶、Northern雜交溶液、N0rthern雜交溶液、O.1%SDS DEPC處理的雙蒸水。
3.儀器及器材60℃水浴箱、平臺(tái)式搖床、硝酸纖維素膜、濾紙、雜交袋、電泳裝置和放射自顯影所需試劑和設(shè)備。
(三)方法
1.凝膠或甲醛凝膠的準(zhǔn)備
(1)配制1.2%瓊脂糖凝膠:將4.2g瓊脂糖加入304.5ml水中(用500ml角燒瓶),放入微波爐內(nèi)溶化后,置于60℃水浴中(凝膠量應(yīng)根據(jù)所需制備的凝膠板大小來(lái)決定,一般是20cm×20cm的凝膠板)。
(2)當(dāng)瓊脂糖凝膠涼至60℃時(shí),加入35ml 10×MOPS電泳緩沖液,并加入10.5ml37%甲醛溶液,充分混勻。
(3)準(zhǔn)備好電泳槽,并將加樣孔成形梳插入,使梳頂端與槽底約有1mm距離,倒入上述甲醛瓊脂糖凝膠溶液,冷卻30~45min,小心抽出梳子,加人1×MOPS電泳緩沖液,淹沒(méi)凝膠表面(加樣孔大小約10 mm×lmm,以便能加入約60ul樣品)。ELISA試劑盒
2.RNA電泳及轉(zhuǎn)移
(1)混合液的配制:用5p110×MOPS電泳緩沖液、8.755μl37%甲醛、25μl甲酰胺。
(2)將RNA樣品加入混合液中,zui后加水至50μl,每種RNA樣品做一重復(fù)對(duì)照:一種RNA樣品的用量為O.5~1.Oμl,如果待測(cè)的RNA在總RNA中含量較高,可以直接用總RNA為樣品(如<0.05%),否則用Poly(A)+RNA代替。
(3)充分混勻樣品,離心5~10s,在55℃中溫育15min。
(4)每種樣品加入10μl甲醛加樣緩沖液,混勻并離心,立即加樣。
(5)5V/cm電泳3h,待二甲苯藍(lán)指示劑泳動(dòng)到凝膠的一半距離時(shí)結(jié)束電泳。
(6)將完成電泳后的凝膠直接轉(zhuǎn)移到一大盤內(nèi),用DEPC理的雙蒸水漂洗數(shù)次,以除去甲醛(轉(zhuǎn)移用RNA凝膠不用EB染色,而重復(fù)對(duì)照組可用EB染色,并與標(biāo)準(zhǔn)RNA的分子量對(duì)照)。
(7)倒出漂洗液,加入500ml 10×SSC盤中,將盤置于平臺(tái)式搖床上輕搖45min。
(8)將凝膠塊置于塑料膠片上,測(cè)量膠塊的長(zhǎng)與寬,然后再將膠塊放人lO×SSC中。
(9)剪下比膠塊約小3mm的一塊硝酸纖維素膜,將硝酸纖維素膜在盤中浸濕約1min,
然后再將膜放入20×SSC中5~10min。操作時(shí)應(yīng)戴手套,防止手上的油脂污染膜面。
(10)將凝膠塊左下角切去,以便定位。準(zhǔn)備一玻璃平臺(tái),置于一裝有20×SSC的大盤之中,在平臺(tái)上鋪上一層濾紙(Whatman 3mm濾紙),此紙要比膠塊寬約2cm、長(zhǎng)30~40cm,使紙兩端浸入臺(tái)下的20×SSC之中,排除濾紙與玻璃板之間的氣泡。
(11)從lO×SSC中輕輕移出凝膠塊,瀝干表面水分,并將其平鋪在玻璃平臺(tái)的濾紙上(注意,不要在凝膠與濾紙之間形成氣泡)。將硝酸纖維素膜從20×SSC中取出,平鋪在膠塊的表面,剪去左下角(注意:硝酸纖維素膜的面積不要大于膠塊,也不能在膜與膠塊之間形成氣泡)。
(12)將準(zhǔn)備好的吸水濾紙2~3張放入20×SSC中浸濕,然后置于吸水紙上,吸干多余水分,將其鋪在硝酸纖維素膜上(注意:這一疊紙的面積不能超過(guò)下面硝酸纖維素膜,四周留出2~3mm,紙與膜之間不能存在氣泡)。
(13)在*層吸水紙之上,放上比層析紙稍小的一疊吸水紙(5~8cm厚),再存吸水紙上加一塊玻璃板,其上可以壓上約500g的重物。轉(zhuǎn)移液在吸水紙的虹吸作用下從容器中轉(zhuǎn)移到吸水紙上,從而帶動(dòng)凝膠中小的RNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。
(14)用保鮮膜將盛有轉(zhuǎn)移液的盤于蓋上,減少蒸發(fā)作用。需要保持轉(zhuǎn)移時(shí)間6~24h,其問(wèn)更換吸水紙1~2次。
(15)用鑷子除去層析紙,將硝酸纖維素膜置于一張干燥濾紙上,用記號(hào)筆標(biāo)明加樣孔的位置。
(16)硝酸纖維素膜用6M×SSC浸泡5min,以去掉瓊脂糖塊。
(17)干燥硝酸纖維素膜,將其置于兩層干燥濾紙之間,70~80℃烘干下2h。
(18)此硝酸纖維素膜可以用于下一步雜交反應(yīng),也可用鋁箔包好,室溫下真空中保存?zhèn)溆谩?/p>
3.預(yù)雜交、雜交和洗膜
(1)將烘干的硝酸纖維素膜放人一個(gè)可以封口的雜交袋內(nèi),加入6~10ml Northern預(yù)雜交溶液(量的多少根據(jù)纖維素膜的大小而定)。封閉雜交袋(預(yù)雜交液應(yīng)加入袋底層,排除其中氣泡,用封口機(jī)將袋口封牢)。前后搖動(dòng)袋子數(shù)次,以使硝酸纖維素膜充分濕潤(rùn)。
(2)于37~42℃恒溫水浴箱中,保溫過(guò)程中不時(shí)將雜交袋搖動(dòng)數(shù)次。
(3)將準(zhǔn)備好的放射性或非放射性標(biāo)記探針置入6~10ml Northern雜交液中,取此液6~10ml,煮沸探針5min,然后加入Northern雜交液混勻。
(4)將雜交袋剪開(kāi)一個(gè)小口,倒出預(yù)雜交液,將袋放在一平面臺(tái)上,用10 ml加樣器頭輕擠壓一下。
(5)加入雜交液與探針混合液,使之在膜上分布均勻,然后再次排出氣泡,密封袋口。為防止放射性污染,可以在袋外再加套一個(gè)保護(hù)袋。
(6)置于37~42℃恒溫水浴箱中。ELISA試劑盒
(7)次日剪開(kāi)袋口,取出硝酸纖維素膜,洗膜。方法如下:用1×SSC加入O.1%SDS,室溫下洗2次,每次15min,然后再加入O.25×SSC(含O.1%SDS),室溫下洗2次,每次15min。
(8)在室溫下.硝酸纖維素膜用O.1×SSC稍稍漂洗,用層析紙吸去硝酸纖維素膜上多余水分。進(jìn)行放射自顯影.一般經(jīng)過(guò)24h后可在x線膠片上顯現(xiàn)RNA條帶。如系非放射性標(biāo)記探針,可用酶或熒光染色分析。
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