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    染色體標(biāo)本制備

    點(diǎn)擊次數(shù):2817  更新時(shí)間:2015-12-31

        細(xì)胞遺傳學(xué)毒性檢測(cè)主要是在分子水平檢測(cè)毒性物質(zhì)對(duì)細(xì)胞遺傳性的影響;在遺傳性疾病的分子診斷和致病機(jī)制研究中,已得到廣泛應(yīng)用。常用的檢測(cè)技術(shù)包括染色體畸變分析、微核試驗(yàn)、基因突變和DNA斷裂檢測(cè)等。

    *節(jié)染色體標(biāo)本制備

        染色體是在顯微鏡下可見(jiàn)的細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中出現(xiàn)的結(jié)構(gòu)。對(duì)染色體檢查分析之前,需要進(jìn)行染色體標(biāo)本制備。通常情況下,都是利用外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行染色體核型分析。正常情況下.人體外周血淋巴細(xì)胞不再分裂,但植物血凝素(phytohemagglutinin,PHA)可刺激血中的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化成淋巴母細(xì)胞,使其恢復(fù)增殖能力。因此,可采取少量外周靜血,做短期培養(yǎng),刺激增殖后進(jìn)入增殖旺盛期,此時(shí)加入秋水仙素抑制細(xì)胞分裂,使細(xì)胞分裂停止在中期以獲得足夠量的分裂期細(xì)胞,經(jīng)低滲、固定、制片、染色后鏡下觀察進(jìn)行核型分析。上述制備的染色體標(biāo)本經(jīng)胰蛋白酶消化、Giemsa染色后,可在染色體縱軸上顯示出著色深、淺相間的橫紋條帶,表明每條染色體的特征。

    一、材料與方法

    (一)實(shí)驗(yàn)材料

    1.受試材料人外周血。

    2.淋巴細(xì)胞分層液 比重為1.077±O.OOl。如Ficoll Hypaque分層液、Percoll—Paque分層液。

    3.RPMll640培養(yǎng)液,含20%小牛血清。

    4.促細(xì)胞分裂劑植物血凝素(PHA)。

    5.秋水仙堿(20μg/m1)。

    6.75 mmol/LMgCl2。

    7.固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)。

    8.Macllvaine’s緩沖液(pH 6.0)。

    9.奎吖因(QM)染液(50μg/ml)。

    10.O.85%生理鹽水。

    11.0.25%胰酶(pH7.2)。

    12.Glemsa染液。

    13.O.2mol/LHCl。

    14.5%Ba(OH)2 。

    15.2×SSc.

    16.磷酸緩沖液(pH 7.2)。

    (二)實(shí)驗(yàn)方法

    1.人外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)

    (1)根據(jù)需要收集全血,加入肝素溶液(O.2ml肝素/10ml全血)抗凝。

    (2)用PBS液將抗凝血稀釋一倍,輕輕混勻。

    (3)將淋巴細(xì)胞分層液加于離心管底部,小心操作,盡量避免碰到管壁。

    (4)再用毛細(xì)管將稀釋的血液沿管壁輕輕加到分層液上面,小心操作,不要將血液沖人分層液中。

    (5)20OOr/min離心20min。離心后輕輕取出離心管,不要破壞分層(圖5—2)??梢?jiàn)從上至下分成4層:*層為稀釋的血漿;第二層為白膜層,主要含淋巴細(xì)胞,還混有少量血小板;第三層為分層液;第四層為粒細(xì)胞和紅細(xì)胞層,紅細(xì)胞沉于管底,粒細(xì)胞是緊貼在紅細(xì)胞層上面的一層薄薄的白膜。

    (6)用注射器或吸管沿試管壁吸出中間的白膜層(吸時(shí)用鈍圓針頭或吸管,而不要用尖的頭吸),加入到另外的離心管中。

    (7)用5倍以上體積的PBS液洗細(xì)胞,1500r/min離心10min,快速吸出上清液。

    (8)再用PBS液洗滌2次,zui后一次洗滌后,細(xì)胞沉淀重懸于5ml培養(yǎng)液中,細(xì)胞計(jì)數(shù)。

    (9)用RPMll640培養(yǎng)液將細(xì)胞配成所需密度,轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中加促細(xì)胞分裂劑。

    (10)終止培養(yǎng)前2~3h,加入濃度為20 μg/ml的秋水仙素,終濃度為O.1μg/ml。輕輕搖勻后,再放入恒溫箱內(nèi),繼續(xù)培養(yǎng)2~3h,以積累較多停止在分裂中期的細(xì)胞。

    2.制片

    (1)收獲細(xì)胞:取出培養(yǎng)瓶,將培養(yǎng)液搖勻后傾入10ml刻度離心管中,1000 r/min離心8~10rnin,吸棄上清液,保留細(xì)胞懸液約O.5ml。

    (2)低滲處理:向離心管中加入6ml已溫浴達(dá)37℃75mmol/L的KCl溶液,用吸管混勻,置37℃恒溫水浴箱中低滲25~30min(的低滲時(shí)間可自行摸索)。

    (3)預(yù)固定:低滲處理完成后,加入1ml新配制的固定液并用吸管混勻,1000 r/min離心8~10min。吸棄上清液。

    (4)固定:加入8ml固定液,用吸管將沉淀的細(xì)胞輕輕混合成細(xì)胞懸液,室溫下靜置如min后,1000 r/min離心8~10min。吸棄上清液。

    (5)再固定:加入8m1固定液,用吸管輕輕吹打使細(xì)胞混勻,室溫下靜止15min或更長(zhǎng)時(shí)間。(若不立即制片,可將離心管口蓋好,置冰箱中或更長(zhǎng)時(shí)間)。

    (6)制片:將上述細(xì)胞混懸液1000 r/min離心8~10min,吸棄上清液,視離心管中沉淀(細(xì)胞)的多少加入O.2~O.4ml左右的固定液,用吸管輕輕混成細(xì)胞懸液(混合后的液體呈淡乳白色即表示細(xì)胞濃度適當(dāng))。用吸管吸取細(xì)胞懸液盡量高距離地的滴于清潔預(yù)冷的玻片上,每片滴1~2滴,靜置并在空氣中晾干,也可在酒精燈火焰上略加烘烤。

    (7)在玻片制成的一周內(nèi)進(jìn)行染色體顯帶。

    3.染色體顯帶一QM熒光染色法

    (1)常規(guī)制備染色體標(biāo)本,要求背景清晰無(wú)核質(zhì)覆蓋。

    (2)浸入pH6.o的Macllvaine’s緩沖液內(nèi)幾秒鐘。

    (3)標(biāo)本放入50μg/ml QM溶液中,染色20min

    (4)用Macllvalne’s緩沖液(或蒸餾水)沖洗3次,每次2min。

    (5)滴數(shù)滴緩沖液于標(biāo)本上,覆蓋以大蓋玻片。

    (6)置熒光顯微鏡下觀察。

    4.染色體顯帶G顯帶染色法

    (1)常規(guī)制作染色體標(biāo)本,置37℃恒溫箱內(nèi)72h。于實(shí)驗(yàn)前6h置60℃烘箱中預(yù)處理6h。

    (2)將O.85%生理鹽水50ml置37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)溫至(37±O.5)℃;將O.25%胰酶溶液用O.85%生理鹽水稀釋?zhuān)K濃度為O.05%,預(yù)溫至(37±O.5)℃。

    (3)將玻片投入胰酶溶液中不停擺動(dòng)1 5~17s。

    (4)取出玻片,立即用l:10 Giemsa染液(pH7.2磷酸緩沖液配制)染色lO~20min。

    (5)自來(lái)水輕輕沖洗,空氣晾干,鏡檢。

    5.染色體顯帶c顯帶染色法

    (1)按常規(guī)法制備染色體標(biāo)本,片齡不超過(guò)3d。

    (2)用O.2 mol/L HCl溶液在室溫下處理15~30 min,以除去組蛋白和非組蛋白。

    (3)自來(lái)水沖洗后,再用蒸餾水沖洗數(shù)秒。

    (4)將標(biāo)本浸于預(yù)溫到55~65℃5%Ba(0H)2水溶液中15~20min。

    (5)立即用自來(lái)水沖洗.去掉污垢,再用蒸餾水沖洗片刻。

    (6)將標(biāo)本置于預(yù)溫的55℃2×SS(:溶液中55℃處理l~1.5h。

    (7)用蒸餾水沖洗數(shù)秒。

    (8)用l:10 Giemsa染液染色20~30min。

    (9)自來(lái)水沖洗,空氣干燥,鏡檢。

    二、結(jié)果分析

    根據(jù)染色體的形態(tài)、大小及著絲粒的位置,將染色體分為七組。

    A組染色體:包括1~3號(hào)染色體。長(zhǎng)度zui長(zhǎng),1號(hào)和3號(hào)染色體為中央著絲粒,2號(hào)染色體為亞中央著絲粒染色體。

    B組染色體:包括4~5號(hào)染色體,長(zhǎng)度次于A組;亞中央著絲粒染色體,短臂較短。

    c組染色體:包括6~12號(hào)和x染色體,中等長(zhǎng)度,亞中央著絲粒染色體。

    D組染色體:包括13~15號(hào)染色體,具有近端著絲粒和隨體。

    E組染色體:包括16~18號(hào)染色體,16號(hào)染色體著絲粒在3/8處,17號(hào)和18號(hào)染色體著絲粒約在1/4處。

    F組染色體:包括19號(hào)和20號(hào)染色體,中央著絲粒。

    G組染色體:包括21號(hào)、22號(hào)和Y染色體,是染色體組中zui小的,為近端著絲粒的染色體。21號(hào)和22號(hào)染色體具有隨體。

    三、注意事項(xiàng)

    (一)接種的血樣要新鮮,如不立即培養(yǎng),應(yīng)放在4~25℃,于24h內(nèi)培養(yǎng)。

    (二)培養(yǎng)箱溫度以(37±O.5℃)為宜。

    (三)培養(yǎng)過(guò)程中如發(fā)現(xiàn)血樣凝集,可將培養(yǎng)瓶輕輕震蕩,使凝塊散開(kāi),然后繼續(xù)培養(yǎng)。

    (四)離心速度過(guò)快,細(xì)胞團(tuán)不易打散,速度過(guò)低,則使分裂象細(xì)胞大量丟失。

    (五)玻片要嚴(yán)格清潔,使細(xì)胞均勻鋪開(kāi)。

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