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    羊水細(xì)胞的培養(yǎng)

    點(diǎn)擊次數(shù):2332  更新時(shí)間:2016-01-18

        羊水細(xì)胞(amniotic cell)是羊水中胎兒脫落細(xì)胞的總稱,可分為上皮樣細(xì)胞、成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞、羊水樣細(xì)胞。羊水細(xì)胞主要用于胎兒染色體疾病和先天性代謝疾病的產(chǎn)前診斷。

    一、材料與試劑

    1.培養(yǎng)液 PRMI 1640、HamF10、HamF、12等培養(yǎng)液均可。一般添加20%胎牛血清或30%小牛血清,谷氨酰胺1mmol/L,青霉素50U/ml,鏈霉素50μg/ml。

    2.分層液 比重為1.077g/ml的Ficoll一Urografin溶液。

    3.清洗液1:1混合的培養(yǎng)基與胎牛血清。

    4.消化液0.25%胰酶一0.1%EDTA混合消化液。

    二、操作方法

    (一)取材

    1.采用羊膜腔穿刺術(shù),妊娠12~30周的羊水細(xì)胞均可培養(yǎng)成功。一般在孕16~20周時(shí),子宮已超出盆腔,易穿刺取得羊水而且羊水中活細(xì)胞比例高,是羊膜腔穿刺行羊水細(xì)胞培養(yǎng)的*時(shí)期。

    2.B超定位后,常規(guī)消毒,采用22號PIE穿刺針,經(jīng)腹壁行羊膜穿刺術(shù)抽取羊水。zui初抽取約2ml羊水棄去,更換注射器后繼續(xù)抽取羊水約15~40ml。留2ml羊水用于計(jì)數(shù)細(xì)胞(活細(xì)胞及血細(xì)胞計(jì)數(shù))。其余羊水注入離心管中,備用。

    (二)羊水細(xì)胞的富集

    1.將注入離心管的羊水,以800r/min離心10min,棄上清液。

    2.加入5ml培養(yǎng)液,用吸管輕輕吹打細(xì)胞沉淀,制成細(xì)胞懸液。

    3.將4ml分層液加入一個(gè)新的離心管中,再將細(xì)胞懸液輕鋪于分層液表面,形成清晰液面。

    4.經(jīng)450r/min離心20min后,離心管中液體分三層,收集第三層,棄上面兩層液體和細(xì)胞沉淀。

    5.向收集到的細(xì)胞懸液中加清洗液清洗,1500r/min。離心7min,棄上清液。重復(fù)清洗1次。

    6.用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,檢測活細(xì)胞數(shù)。

    (三)培養(yǎng)方法

    1.以1×105個(gè)/m1的活細(xì)胞密度接種,置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

    2.培養(yǎng)5d后,若觀察到有較好的梭形細(xì)胞克隆則更換新鮮培養(yǎng)液。以后每隔2d換一次液。

    3.當(dāng)培養(yǎng)瓶中長出幾個(gè)孤立的細(xì)胞克隆時(shí),棄培養(yǎng)液,用PBS洗,再加少量O.25%胰酶一O.1%EDTA消化液,消化5~10min。

    4.加入培養(yǎng)液終止消化反應(yīng),用吸管吹打細(xì)胞使之集落分散。

    5.分散的細(xì)胞仍可保留在原培養(yǎng)瓶,加入培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后即可換液。以后每2d換液一次,并逐日觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。

    三、注意事項(xiàng)

    1.在準(zhǔn)備接種用的細(xì)胞懸液時(shí),保留一定量的羊水,以保持體內(nèi)生長條件,利于羊水細(xì)胞的培養(yǎng)。

    2.在體外培養(yǎng)時(shí),羊水細(xì)胞不易貼壁,所以在培養(yǎng)的前幾天要靜置培養(yǎng)。

    3.*次換液時(shí),如果細(xì)胞生長狀態(tài)良好,可以全量換液;若細(xì)胞狀態(tài)不好,半量換液為宜。

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