多數(shù)細(xì)胞系和原代細(xì)胞都會(huì)以一種單層的形式生長(zhǎng)(單層細(xì)胞)或者覆蓋在玻璃或經(jīng)處理的塑料物體表面。為了保持細(xì)胞的健康與活躍增殖,通常需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行有規(guī)律的傳代。
zui常見(jiàn)的傳代方法是使用蛋白酶如胰酶或膠原酶破壞細(xì)胞間以及細(xì)胞與培養(yǎng)介質(zhì)間的連接。當(dāng)細(xì)胞被解離成單細(xì)胞懸液時(shí),再將它們稀釋并分發(fā)至新的培養(yǎng)容器中。在那里,細(xì)胞可以重新貼壁生長(zhǎng)和分裂,然后經(jīng)過(guò)一段時(shí)間培養(yǎng),細(xì)胞又再一次長(zhǎng)滿(mǎn)(接近匯合)。此時(shí),細(xì)胞又需要進(jìn)行傳代或用于下游實(shí)驗(yàn)。
注意:以下指南描述了典型單層細(xì)胞的常規(guī)傳代與維持的基本原則。為了得到一致的結(jié)果,堅(jiān)持良好的培養(yǎng)記錄非常重要,記錄應(yīng)包括細(xì)胞傳代的日期和傳代的次數(shù)。
細(xì)胞的檢查:應(yīng)該養(yǎng)成良好的習(xí)慣對(duì)細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)的和認(rèn)真的檢查,以了解它們的狀態(tài)和健康情況。
首先,用肉眼檢查培養(yǎng)容器中是否存在可見(jiàn)的微生物污染,比如培養(yǎng)基pH改變、渾濁或有顆粒樣的物體。同時(shí)也要注意觀察有沒(méi)有小的真菌菌落,因?yàn)樗鼈冊(cè)陲@微鏡下不易被發(fā)現(xiàn)。這些菌落可能會(huì)飄浮在液體表面,特別是在培養(yǎng)容器周邊附近。
其次,在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞常規(guī)形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài),留意檢查任何鏡下可見(jiàn)的微生物污染的跡象。在某些細(xì)胞系中,培養(yǎng)液中漂浮的細(xì)胞通常是死亡的細(xì)胞。但是,許多細(xì)胞在進(jìn)行有絲分裂的時(shí)候也會(huì)變圓,形成折光性很強(qiáng)(很亮)的球體,并且在受到擾動(dòng)后也會(huì)飄浮起來(lái)。兩者的區(qū)別在于,死細(xì)胞通常會(huì)變圓脫落但一般折光性不會(huì)很強(qiáng)。
除了這些日常檢查外,還需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行周期性的真菌、細(xì)菌以及支原體檢查。
培養(yǎng)液的準(zhǔn)備:準(zhǔn)備針對(duì)特定細(xì)胞系在購(gòu)買(mǎi)或文獻(xiàn)中推薦使用的新鮮培養(yǎng)液,并用記號(hào)筆在培養(yǎng)容器上標(biāo)記傳代時(shí)間和細(xì)胞代數(shù)等信息。確保添加了補(bǔ)充成分(如:谷氨酰胺、生長(zhǎng)因子、抗生素等)并且預(yù)先放置培養(yǎng)箱進(jìn)行了pH平衡。一個(gè)75cm2的培養(yǎng)瓶大約需要12-15ml培養(yǎng)液,如何使用其他規(guī)格的培養(yǎng)容器需要進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。
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