實驗步驟
1. 細胞在含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中生長。
2. 細胞以一定密度接種到24孔細胞培養(yǎng)板中,生長24小時后,單層細胞融合度應(yīng)達到70-80%。
3. 不要更換培養(yǎng)基。用新的1ml槍頭輕輕的在單層培養(yǎng)細胞間劃痕,劃痕橫穿過孔,槍頭盡量與板孔的底部垂直,不要傾斜。這樣產(chǎn)生的gap的距離才與槍頭末端的外直徑相等。Gap的距離可以選用不同型號的槍頭調(diào)節(jié)。劃痕在同一方向成一條直線。
4. 在垂直與*條劃痕的方向制作另一條劃痕,每孔劃痕成十字交叉型。
5. 劃痕后,用培養(yǎng)基輕輕的清洗板孔2次,以去除脫落細胞。
6. 每孔添加新鮮培養(yǎng)基。
7. (培養(yǎng)基中含有某些成分,如抑制/促進細胞遷移和/或增殖的化學(xué)物質(zhì))。
8. 細胞生長48小時(或根據(jù)時間需要)。
9. 1xPBS清洗細胞兩次,然后使用3.7%多聚甲醛固定30分鐘。
10. 0.1%的結(jié)晶紫(2%乙醇溶解)染色30分鐘。
11. 染色的單層細胞選取不同的視野,顯微鏡拍照。gap的距離可通過Photoshop或ImagJ軟件測量.為了降低實驗結(jié)果的可變性,建議每孔選擇多個視野觀察,每組做多個重復(fù)。
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