通過生化和遺傳學研究表明,RNA干擾包括起始階段和效應(yīng)階段(inititation and effector steps)。在起始階段,加入的小分子RNA被切割為21-23核苷酸長的小分子干擾RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。證據(jù)表明;一個稱為Dicer的酶是RNase III家族中特異識別雙鏈RNA的一員,它能以一種ATP依賴方式逐步切割由外源導入或者由轉(zhuǎn)基因,病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA,切割將RNA降 解為19-21bp的雙鏈RNAs(siRNAs),每個片段的3’端都有2個堿基突出。細胞
在RNAi效應(yīng)階段,siRNA雙鏈結(jié)合一個核酶復(fù)合物從而形成所謂RNA誘導沉默復(fù)合物(RNA-induced silencingcomplex, RISC)。激活RISC需要一個ATP依賴的將小分子RNA解雙鏈的過程。激活的RISC通過堿基配對定位到同源mRNA轉(zhuǎn)錄本上,并在距離 siRNA3’端12個堿基的位置切割mRNA。盡管切割的確切機制尚不明了,但每個RISC都包含一個siRNA和一個不同于Dicer的RNA酶。
另外,還有研究證明含有啟動子區(qū)的dsRNA在植物體內(nèi)同樣被切割成21-23nt長的片段,這種dsRNA可使內(nèi)源相應(yīng)的DNA序列甲基化,從而使啟動子失去功能,使其下游基因沉默.
實驗步驟
1. siRNA的設(shè)計
1) 在設(shè)計RNAi實驗時,可以先在以下進行目標序列的篩選:
2) RNAi目標序列的選取原則:
A.從轉(zhuǎn)錄本(mRNA)的AUG起始密碼開始,尋找“AA"二連序列,并記下其3'端的19個堿基序列,作為潛在的siRNA靶位點。有研究結(jié)果顯示 GC含量在45%-55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。設(shè)計siRNA時不要針對5'和3'端的非編碼區(qū)(untranslated regions,UTRs),原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域,而這些UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會影響siRNP核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié) 合mRNA從而影響siRNA的效果。細胞
B. 將潛在序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫(人,或者小鼠,大鼠等)進行比較,排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。
C. 選出合適的目標序列進行合成。通常一個基因需要設(shè)計多個靶序列的siRNA,以找到zui有效的siRNA序列。
3) 陰性對照
一個完整的siRNA實驗應(yīng)該有陰性對照,作為陰性對照的siRNA應(yīng)該和選中的siRNA序列有相同的組成,但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常做法是將選中的siRNA序列打亂,同樣要檢查結(jié)果以保證它和目的靶細胞中其他基因沒有同源性。
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