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    制備單抗的方法

    點(diǎn)擊次數(shù):2280  更新時(shí)間:2016-02-19

        獲得穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞系后,即可根據(jù)需要大量單抗,以用于不同目的。

    一、單抗的大規(guī)模制備

        目前大量制備單抗的方法主要有兩大系統(tǒng),一是動(dòng)物體內(nèi)法,這是國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室所廣泛采用;另一是體外培養(yǎng)法。

    1、動(dòng)物體內(nèi)單抗的方法

        迄今為止,通常情況下均采用動(dòng)物體內(nèi)單抗的方法,鑒于絕大多數(shù)動(dòng)物用雜交瘤均由BALB/c小鼠的骨髓瘤細(xì)胞與同品系的脾細(xì)胞融合而得,因此使用的動(dòng)物當(dāng)然BALB/c小鼠。本方法即將雜交瘤細(xì)胞接種于小鼠腹腔內(nèi),在小鼠腹腔內(nèi)生長(zhǎng)雜交瘤,并產(chǎn)生腹水,因而可得到大量的腹水單抗且抗體濃度很高??梢?jiàn)該法操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì),不過(guò),腹水中常混有小鼠的各種雜蛋白(包括Ig),因此在很多情況下要提純后才能使用,而且還有污染動(dòng)物病毒的危險(xiǎn),故而用SPF級(jí)小鼠。

    (1)材料:

    a. 成年BALB/c小鼠。

    b. 降植烷(Pristane)或液體石蠟。

    c. 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞。

    (2)方法:

    a. 腹腔接種降植烷或液體石蠟,每只小鼠0.3-0.5ml。

    b. 7-10天后腹腔接種用PBS或無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋的雜交瘤細(xì)胞,每只小鼠5×105/0.2ml。

    c. 間隔5天后,每天觀察小鼠腹水產(chǎn)生情況,如腹部明顯膨大,以手觸摸時(shí),皮膚有緊張感,即可用16號(hào)針頭采集腹水,一般可連續(xù)采2-3次,通常每只小鼠可采 5-10ml腹水;

    d. 將腹水離心(2000r/min 5分鐘),除去細(xì)胞成分和其他的沉淀物,收集上清,測(cè)定抗體效價(jià),分裝,-70℃凍存?zhèn)溆茫騼龈杀4妗?/p>

    二、體外培養(yǎng)單抗的方法

        總體上講,雜交瘤細(xì)胞系并不是嚴(yán)格的貼壁依賴(lài)細(xì)胞(anchorage dependent cell,ADC),因此既可以進(jìn)行單層細(xì)胞培養(yǎng),又可以進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。雜交瘤細(xì)胞的單層細(xì)胞培養(yǎng)法是各個(gè)實(shí)驗(yàn)室zui常用的手段,即將雜交瘤細(xì)胞加入培養(yǎng)瓶中,以含10-15%小牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng),細(xì)胞濃度以1×106-2×106/ml為佳,然后收集培養(yǎng)上清,其中單抗含量約10-50ug/ml。顯然,這種方法制備的單抗量極為有限,無(wú)疑是不適用于單抗的大規(guī)模。要想在體外大量制備單抗,就必須進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的大量(高密度)培養(yǎng)。單位體積內(nèi)細(xì)胞數(shù)量越多,細(xì)胞存活時(shí)間越長(zhǎng),單抗的濃度就越高,產(chǎn)量就越大。

        目前在雜交瘤細(xì)胞的大量培養(yǎng)中,主要有兩種類(lèi)型的培養(yǎng)系統(tǒng)。其一是懸浮培養(yǎng)系統(tǒng),采用轉(zhuǎn)瓶或發(fā)酵罐式的生物反應(yīng)器,其中包括使用微載體;其二是細(xì)胞固定化培養(yǎng)系統(tǒng),包括中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和微囊化細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。

    1、懸浮培養(yǎng)法

        目前小規(guī)模懸浮培養(yǎng)多采用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng),通過(guò)攪拌使細(xì)胞呈懸浮狀態(tài);而大規(guī)模懸浮培養(yǎng)多采用發(fā)酵式的生物反應(yīng)器,美國(guó)、加拿大、法國(guó)和德國(guó)等幾家公司這類(lèi)反應(yīng)器,其培養(yǎng)方式可分為純批式、流加式、半連續(xù)式和連續(xù)式。

    2、微載體培養(yǎng)法

        微載體(Microcarrier)是以小的固體顆粒作為細(xì)胞生長(zhǎng)的載體,在攪拌作用下微載體 懸浮于培養(yǎng)液中,細(xì)胞則在固體顆粒表面生長(zhǎng)成單層??捎米骷?xì)胞大量培養(yǎng)的微載體主要以交聯(lián)瓊脂糖或葡聚糖、聚苯乙烯、玻璃等作為基質(zhì)的產(chǎn)品,其中以 Cytodex I,Biosilon和Superbeads為好。微載體培養(yǎng)的基本方法上與懸浮培養(yǎng)相同。近來(lái)的研究表明,該法是雜交瘤細(xì)胞大量培養(yǎng)的理想途徑之一。

    3、中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)

        該系統(tǒng)由中空纖維生物反應(yīng)器、培養(yǎng)基容器、供氧器和蠕動(dòng)泵等組成。用于細(xì)胞培養(yǎng)的中空纖維由乙酸纖維、聚氯乙烯-丙烯復(fù)合物、多聚碳酸硅等材料制成,外徑一般為100-500um,壁厚25-75um,壁呈海綿狀,上面有許多微孔。中空纖維的內(nèi)腔表面是一層半透性的超濾膜,其孔徑只允許營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物出入,而對(duì)細(xì)胞和大分子物質(zhì)(如單抗等)有滯留作用。目前使用的中空纖維生物反應(yīng)器分為柱式、板框式和中心灌流式。盡管該培養(yǎng)系統(tǒng)在大規(guī)模單抗時(shí)成本較低,并可獲得高產(chǎn)量高純度的抗體,由于設(shè)備價(jià)格昂貴,限制了其使用范圍。

    4、微囊化細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)

        該系統(tǒng)是先將雜交瘤細(xì)胞微囊化,然后將此具有半透膜的微囊置于培養(yǎng)液中進(jìn)行懸浮培養(yǎng),一定時(shí)間后,從培養(yǎng)液中分離出微囊,沖洗后打開(kāi)囊膜,離心后即可獲得高濃度的單抗。

        總之,上述四種體外培養(yǎng)單抗的方法仍處在發(fā)展之中;隨著研究的不斷深入和技術(shù)的完善,它們將會(huì)在單抗的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程中發(fā)揮越來(lái)越大的作用。

    三、雜交瘤細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)

        雜交瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)絕大多數(shù)應(yīng)用DMEM或RPMI-1640為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,添加10-20%胎?;蛐律∨Q??;A(chǔ)培養(yǎng)基主要提供各種氨基酸、維生素、葡萄糖、無(wú)機(jī)鹽、各種合成核酸和脂質(zhì)的前體物質(zhì)。而血清主要供給雜交瘤細(xì)胞等各種營(yíng)養(yǎng)成分,血清中的激素可刺激細(xì)胞生長(zhǎng),其中的許多蛋白質(zhì)能結(jié)合有毒性的離子和熱源質(zhì)而起解毒作用,同時(shí)這些蛋白質(zhì)對(duì)激素、維生素和脂類(lèi)有穩(wěn)定和調(diào)節(jié)作用。但是,血清中含有上百種的蛋白質(zhì),這給單抗的純化帶來(lái)的麻煩,而未純化的含有異種蛋白的單抗用于動(dòng)物治療可誘發(fā)變態(tài)反應(yīng);加之,血清來(lái)源有限;每批血清之間質(zhì)量差異較大,直接影響結(jié)果的穩(wěn)定性,同時(shí)血清是雜交瘤細(xì)胞發(fā)生支原體污染的zui主要來(lái)源之一,而且價(jià)格較貴,為了克服血清的這些缺點(diǎn),采用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞越來(lái)越受到廣泛重視。

        無(wú)血清培養(yǎng)的實(shí)質(zhì)就是用各種不同的添加劑來(lái)代替血清,然后進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)。目前已報(bào)道的各類(lèi)無(wú)血清培養(yǎng)基有含有大豆類(lèi)脂的、含有酪蛋白的、化學(xué)限定性的、無(wú)蛋白的、含有血清低分子量成分的無(wú)血清培養(yǎng)基,其中一部分已有產(chǎn)品出售。綜合這些無(wú)血清培養(yǎng)基,約有幾十種不同的添加劑可用于無(wú)血清培養(yǎng)基,在其中至少必須添加胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、乙醇胺這三種成分,才能起到類(lèi)似血清的作用,其他較重要的添加劑包括白蛋白、亞油酸和油酸、抗壞血酸以及錳等一些微量元素。

        采用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞制備單抗,有利于單抗的純化,有助于大規(guī)模,可減少細(xì)胞污染的機(jī)會(huì),且成本較低。但無(wú)血清培養(yǎng)細(xì)胞的率低、細(xì)胞密度小,影響了單抗的產(chǎn)量;同時(shí)無(wú)血清培養(yǎng)基還缺少血清中保護(hù)細(xì)胞免受環(huán)境中蛋白酶損傷的抑制因子等。盡管如此,無(wú)血清培養(yǎng)基終究會(huì)成為雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)的理想的培養(yǎng)基。

     

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