1)訓(xùn)練目的
了解細(xì)胞活性檢查的原理;掌握染料的配制方法;掌握細(xì)胞活性檢查方法。
2)實(shí)驗(yàn)原理
細(xì)胞損傷或死亡時(shí),某些染料可穿透變性的細(xì)胞膜,與解體的DNA結(jié)合,使其著色。而活細(xì)胞能阻止這類染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),因此可以鑒別死細(xì)胞與活細(xì)胞。常用的染料有臺(tái)盼藍(lán)、苯胺黑、結(jié)晶紫。
3)實(shí)驗(yàn)材料
①臺(tái)盼藍(lán)、苯胺黑、結(jié)晶紫溶液(溶于Hank's液或BSS液)。
②冷凍復(fù)蘇后的細(xì)胞或其他培養(yǎng)細(xì)胞。
③研缽、濾紙、漏斗、試劑瓶、標(biāo)簽紙、顯微鏡、膠頭滴管、鑷子、載玻片、蓋玻片、計(jì)數(shù)器。
4)操作步驟
(1)配制染色液
①0.5%臺(tái)盼藍(lán)法:0.5g臺(tái)盼藍(lán)加熱溶于100 mLHank's液或BSS液中,貼標(biāo)簽。
(1)0.05%苯胺黑:0.05 g苯胺黑充分研磨后溶于100 mL Hank's液或BSS液中。苯胺黑對細(xì)胞毒性小,但溶解度差.配制后需過濾,貼標(biāo)簽。
③0.1%結(jié)晶紫(用BSS液配制)法:0.1g結(jié)晶紫分別研磨溶于.100mL Hank's液或BSS液中,過濾后貼標(biāo)簽。
(2)制備細(xì)胞懸液
調(diào)整細(xì)胞濃度在1×106個(gè)/mL左右。
(3)染色
①0.5%臺(tái)盼藍(lán)法:取少量細(xì)胞懸液,按l:1量加入0.5%臺(tái)盼藍(lán)染色液,充分混勻。靜置15 min,用膠頭滴管吸取細(xì)胞懸液,滴1滴于載坡片上,加蓋玻片。1 min后用10x物鏡移動(dòng)視野觀察,計(jì)數(shù)100~200個(gè)細(xì)胞?;罴?xì)胞圓形透明,死細(xì)胞染成藍(lán)色,用活細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞中的百分比表示細(xì)胞活力。
②0.05%苯胺黑法:使用時(shí),苯胺黑液與細(xì)胞懸液以1:10混合,稍放置后鏡檢,死細(xì)胞染成黑色,活細(xì)胞不著色。
③0.1%結(jié)晶紫法:細(xì)胞懸液與結(jié)晶紫液等量混合后,立即鏡檢,著紫色的為活細(xì)胞。
5)注意事項(xiàng)
①染色時(shí)間不能太長,否則活細(xì)胞也會(huì)逐漸積累染料而染成顏色,使檢測結(jié)果偏低。
②可結(jié)合細(xì)胞計(jì)數(shù)方法,同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和活力檢測。
③細(xì)胞活性檢查是細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)。它是檢測不同藥物、生化物質(zhì)處理等效果的直觀簡便手段,也是評定細(xì)胞冷凍效果的方法之一。在細(xì)胞凍存和復(fù)蘇過程中,由于細(xì)胞遭受非生理性的低溫打擊等,不可避免地對細(xì)胞產(chǎn)生影響,引起部分細(xì)胞活力下降或死亡,通過細(xì)胞活性檢查可快速檢驗(yàn)細(xì)胞冷凍效果,是衡量細(xì)胞凍存、復(fù)蘇效果的一種簡便易行的方法:染料排除法是檢查細(xì)胞活性常用的方法。
④檢查貼壁的細(xì)胞時(shí),應(yīng)先將細(xì)胞消化然后再進(jìn)行操作。
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