胰島素對離體犢牛小腸上皮細(xì)胞增殖及吸收功能影響的實驗
(一)試驗原理
新生哺乳動物胃腸道的生長發(fā)育非常迅速,這與初乳的攝入有關(guān),初乳中含大量多肽類生長因子如胰島素等。本實驗通過體外犢牛小腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)法,用細(xì)胞增殖率和葡萄糖吸收率作為細(xì)胞生長發(fā)育及功能成熟的指標(biāo),探討胰島素或其他生長因子對細(xì)胞生長發(fā)育的影響,同時為新生胃腸道營養(yǎng)發(fā)育生理研究提供研究方法。
(二)材料
1.待檢藥物胰島素(o.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml及50μg/m1)。
2.動物出生1日齡以內(nèi)未吮乳的中國荷斯坦?fàn)俟!?/p>
3.試劑DMEM/F12培養(yǎng)液、DMSO、臺盼藍(lán)、15%NCS、葡萄糖。
4.器材37℃水浴箱、酶標(biāo)儀。
(三)實驗方法
1.細(xì)胞分離和培養(yǎng)出生1日齡以內(nèi)未吮乳的中國荷斯坦?fàn)俟T讱⒑蠓叛瑹o菌條件下取十二指腸約10cm,迅速放人37℃生理鹽水中。按照Evans方法制取小腸細(xì)胞,用染色法進(jìn)行細(xì)胞計數(shù),存活的細(xì)胞活力大于85%時可進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。將細(xì)胞按1×105/ml接種于24孔培養(yǎng)板上,在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。48h后更換為含不同濃度胰島素(0.01μg/ml、O.1μg/ml、1μg/ml、lOμg/ml及50μg/ml)的DMEM/F 12培養(yǎng)液,用無血清培養(yǎng)液作為對照。繼續(xù)培養(yǎng)72 h 后,測定細(xì)胞增殖率。
2.細(xì)胞增殖率的測定 各組細(xì)胞更換培養(yǎng)液培養(yǎng)。72h后,棄去培養(yǎng)液,每孔加入200μl無血清的DMEM/F12及200μl 0.05%MTT,在5%C02、37℃孵箱中培養(yǎng)4h,棄去培養(yǎng)液和MTT,每孔加入O.5ml DMSO,用酶標(biāo)儀測定0D540。
3.葡萄糖吸收率的測定配制葡萄糖濃度為4mg/ml的生理鹽水溶液,用其稀釋胰島素,使之濃度分別為O.Olμg/ml、O.1μg/m1、1μg/ml、10μg/ml及50μg/ml。細(xì)胞分離后在含15%NCS的DMEM/F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)48h,分別用各實驗組生理鹽水孵育細(xì)胞30min,然后按試劑盒要求測葡萄糖吸收量(葡萄糖吸收量=總葡萄糖含量一剩余量)。
(四)結(jié)果與分析
濃度為O.01μg/ml的胰島素作用很小,與對照組無顯著性差異(P>0.05),無促細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞吸收葡萄糖的作用。隨著濃度的增加,胰島素的促增殖作用及促細(xì)胞吸收葡萄糖的作用逐漸增強。但當(dāng)胰島素濃度達(dá)到50μg/ml的超生理濃度時,胰島素反而抑制細(xì)胞增殖,并抑制細(xì)胞吸收葡萄糖。
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