一、原理與意義
免疫熒光組織(細(xì)胞)化學(xué)染色方法——補(bǔ)體法,是一種熒光抗體染色法。本法之熒光抗體不受免疫血清的動(dòng)物種屬的限制,因而一種熒光抗體可作更廣泛的應(yīng)用,敏感性亦較間接法高,效價(jià)低的免疫血清亦可應(yīng)用,節(jié)省免疫血清,尤其是對檢查形態(tài)小的如立克氏體、病毒顆粒等或濃度較低的抗原物質(zhì)時(shí)甚為理想。
二、操作指南
1、材料
(1)免疫血清60℃滅活20min,用Kolmers鹽水作2倍稀釋成1:2,1:4,1:8……。補(bǔ)體用1:10稀釋的新鮮豚鼠血清,抗補(bǔ)體熒光抗體等,按下述的補(bǔ)體法染色。免疫血清補(bǔ)體結(jié)合的效價(jià),如為1:32則免疫血清應(yīng)作1:8稀釋。
(2)補(bǔ)體用新鮮豚鼠血清一般作1:10稀釋或按補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)試管法所測定的結(jié)果,按2單位的比例,用Kolmers鹽水稀釋備用。Kolmers鹽水配法:即在pH7.4、0.1mol/L的磷酸緩沖鹽水中,溶解MgSO4的含量為0.01%濃度。
(3)抗補(bǔ)體熒光抗體:在免疫血清效價(jià)為1:4,補(bǔ)體為2單位的條件下,用補(bǔ)體染色法測定免疫豚鼠球蛋白熒光抗體的染色效價(jià),然后按染色效價(jià)1:4的濃度用Kolmers鹽水稀釋備用。
2、操作步驟
(1)涂片或切片固定。
(2)吸取經(jīng)適當(dāng)稀釋之免疫血清及補(bǔ)體之等量混合液(此時(shí)免疫血清及補(bǔ)體又都稀釋一倍)滴于切片上,37℃作用30min,置于保持一定濕度的染色盒內(nèi)。
(3)用緩沖鹽水洗2次,攪拌,每次5min,吸干標(biāo)本周圍水液。
(4)滴加經(jīng)過適當(dāng)稀釋之抗補(bǔ)體熒光抗體30min,37℃,水洗同(3)。
(5)蒸餾水洗1min,緩沖甘油封固。
3.對照染色
(1)抗原對照。
(2)抗血清對照:用正常兔血清代替免疫血清。
(3)滅活補(bǔ)體對照:將補(bǔ)體經(jīng)56℃ 30min處理后,按補(bǔ)體同樣比例稀釋,與免疫血清等量混合后,進(jìn)行補(bǔ)體法染色。
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